【試劑盒簡介】

????? 禽流感病毒RT-PCR 檢測試劑盒，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR ）技術(shù)檢測禽組織、分泌物和排泄物中所有亞型的AIV，適用于AIV的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

【原理】

????? 利用吸附柱提取RNA作為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以引物為起點(diǎn)合成與RNA 模板互補(bǔ)的cDNA鏈；然后在DNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán)，使特異DNA 片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬倍。將擴(kuò)增的DNA 片段進(jìn)行電泳、染色后，在紫外燈下，肉眼可見DNA 片段的擴(kuò)增帶。

【試劑盒組份】

注：塑料袋內(nèi)試劑（陽性對照、RT-PCR反應(yīng)液A和B）-20?℃凍存，裂解液2-8℃冷藏，其他室溫保存。

【操作方法】

一、樣品制備

1樣品采集：病死或撲殺的禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于50%甘油生理鹽水中，2～8 ℃保存。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。）

2樣品處理：

2.1 組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物；然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5 mL滅菌離心管中，8000 rpm離心2 min，取100 μL上清于1.5 mL 滅菌離心管中。

2.2 全血樣品的處理：待血凝后取100 μL血清于1.5 mL 滅菌離心管中。

2.3 陽性對照的處理：取陽性對照 100 μL于1.5 mL 滅菌離心管中。

2.4 陰性對照的處理：取陰性對照100 μL于1.5 mL 滅菌離心管中。

二、病毒RNA的提取

1. 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入450μL裂解液，充分顛倒混勻，室溫靜置3min 。

2. 加入275μL無水乙醇，輕輕混勻。

3. 將混合液吸入吸附柱中（吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時(shí)堵塞吸附柱），10,000 rpm 離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。

4. 向吸附柱中加入500μL洗滌液A，10,000 rpm 離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。

5. 向吸附柱中加入500μL洗滌液B，10,000 rpm 離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。

6. 空柱10,000 rpm 離心2 min。

7. 將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5 mL離心管中，在膜中央加入30μL洗脫液，室溫靜置2min，10,000 rpm 離心1min，獲得總RNA。

三、RT-PCR

1. 反應(yīng)體系：分別取14μL RT-PCR反應(yīng)液A（用前混勻）、4μL RT-PCR反應(yīng)液B（用前混勻）和2μL模板RNA，混勻。

2. 反應(yīng)程序：在PCR儀上運(yùn)行以下程序：42 ℃ 45 min，94 ℃ 3 min ；94 ℃ 30 s 、53℃ 30 s 、72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

四、電泳

1. 制膠：用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。

2. 電泳：待膠凝固后，取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm的電壓于50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液中電泳。

3. 染色：取50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液30mL，加入10μL染色液，混勻后將膠浸泡30min，于紫外燈下觀察結(jié)果。

【結(jié)果判斷】

????? 陽性對照出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶，陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶為禽流感病毒陽性，否則為陰性。

【需用但未提供的材料】

????? 組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC ）處理的滅菌1.5mL 離心管和吸頭（10 μL、200 μL、1000 μL）。

【注意事項(xiàng)】

1．本試劑盒有效期為6個(gè)月，不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的組分不要混用。

2．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存，使用時(shí)拿到室溫下，使用后立即放回。

3．注意防止試劑盒組分受污染。使用前將塑料袋內(nèi)試劑瞬離15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。

4．嚴(yán)格按試劑盒說明書操作可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)等全部過程必須精確。

5．RNA提取過程中，應(yīng)戴口罩、勤換手套，盡量縮短操作時(shí)間。

6．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處理，以免污染實(shí)驗(yàn)室。

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